Sposób prognozowania stopnia ciężkości przebiegu wirusowego zakażenia SARS-Cov-2 w chorobie COVID-19 oraz test diagnostyczny

ZESPÓŁ AUTORSKI:

Uniwersytet Medyczny w Łodzi

• prof. dr hab. n. med. Przemysław Lewkowicz - kierownik zespołu
• dr hab. n. med. Natalia Lewkowicz
• dr n. med. Paweł Piątek
• dr n. med. Magdalena Namiecińska

CO MOŻNA OSIĄGNĄĆ DZIĘKI WYNALAZKOWI?

Wynalazkiem jest laboratoryjny test diagnostyczny dedykowany pacjentom chorym na COVID19 (Coronavirus Disease 2019) podczas zakażenia wirusem SARS-Cov-2 (severe acute respiratory syndrome coranavirus 2),celem prognozowania stopnia ciężkości przebiegu choroby oraz oceny skuteczność szczepienia na COVID19 w stosunku do nowo pojawiających się wariantów wirusa.
Oba zastosowania testu wynikają z naturalnych, wspólnych dla zakażenia jak i immunizacji szczepionką, mechanizmów odpowiedzi immunologicznej człowieka, związanych z indukcją swoistych limfocytów.
Zastosowanie nr 1. W przebiegu zakażenia wirusem SARS-Cov-2, w niektórych grupach pacjentów dochodzi do wysokiej śmiertelności. Kluczowym elementem diagnostyki jest wczesna selekcja pacjentów szczególnie zagrożonych utratą życia. Czynniki prognostyczne obecnie wykorzystywane takie jak: wiek pacjenta, temperatura ciała, saturacja krwi, okazują się niewystarczające do przeprowadzania prawidłowej selekcji pacjentów. Ogólna zasada testu opiera się na uchwyceniu momentu, w którym odpowiedź immunologiczna zależna od mechanizmów wrodzonych (innate immunity) jest zastępowana mechanizmami swoistymi (acquired immunity). Pacjenci, u których zaobserwujemy rozwój odpowiedzi swoistej zależnej od swoistych limfocytów jest pozytywnym czynnikiem prognostycznym. Brak takiej odpowiedzi skutkuje rozwojem mechanizmów wrodzonych i klasyfikuje pacjentów do grupy o podwyższonym ryzyku zejścia śmiertelnego. Zastosowanie nr 2. Od momentu przyjęcia programu szczepień przeciwko zakażeniu SARS-Cov-2 kwestią sporną jest skuteczności immunizacji. Zarówno różne strategie przyjęte w szczepieniu (szczepionka typu ‘mRNA’, DNA czy typu ‘wektorowa lub ich kombinacji’), jak i nowo pojawiające się warianty wirusa różniące się właściwościami antygenowymi budzą uzasadnione wątpliwości, czy dany rodzaj szczepionki ma działanie protekcyjne; czy przyjmowanie leków immunosupresyjnych (pacjenci z chorobami autoimmunizacyjnymi) spowoduje, iż u tych osób nie rozwinie się swoista odpowiedź immunologiczna? Proponowany przez nas test w sposób wysoce informatywny udzieli informacji czy u osoby poddanej szczepieniu rozwinęła się swoista odpowiedź immunologiczna, niezależnie od strategii immunizacji przyjętej w szczepionce i czy dany rodzaj szczepionki chroni pacjenta przed pojawiającymi się nowymi wariantami wirusa.

ISTOTA WYNALAZKU

Istotą wynalazku jest monitorowanie rozwoju odpowiedzi immunologicznej pacjenta wykazując efektywność jego układu odpornościowego w krytycznych momentach przebiegu infekcji wirusowej. Proponowane przez nas rozwiązanie opiera się na wykazaniu obecności w organizmie osób chorych na COVID19 czy też poddanych szczepieniu, swoistych limfocytów w stosunku do antygenów wirusa. Zasada testu, w przypadku osób chorych na COVID19 zakłada, iż rozwój odpowiedzi nabytej zależnej od swoistych limfocytów w stosunku do antygenów wirusa SARS-Cov-2 przy jednoczesnym wyciszaniu odpowiedzi wrodzonej związanej z komórkami linii mieloidalnej, jest pozytywnym czynnikiem prognostycznym przebiegu choroby. Brak takiej odpowiedzi skutkuje rozwojem mechanizmów wrodzonych (obecne młode formy neutrofilii w rutynowym badaniu morfologii krwi obwodowej) i klasyfikuje pacjentów do grupy z podwyższonym ryzykiem śmiertelności. Moment przejęcia funkcji przez mechanizmy nabyte układu odporności obserwujemy poprzez pojawienie się wirusowo-specyficznych limfocytów o fenotypie CD154/CD45.
Zasada testu oparta jest na detekcji ekspansji limfocytów CD154/CD45 w całkowitej populacji izolowanych komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC) osoby zakażonej antygenemi wirusa, jakim są białka kapsydu (SARS-Cov-2 nucleocapside protein) oraz wybrane peptydy o właściwościach antygenowych (SARS-Cov-2 spike protein) w teście proliferacji ocenianej metodą cytometrii przepływowej przy użyciu odczynnika CSFE (5,6-carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester). W przypadku oceny skuteczności szczepienia przeciw nowym wariantom wirusa modyfikacja testu polega na zastosowaniu syntetycznych peptydów wirusowych lub jego kapsydu, odpowiadających nowemu wariantowi wirusa.
Okres 72 h inkubacji w warunkach in vitro pozwala na fagocytozę antygenu, prezentacji go przez komórki prezentujące antygen w kontekście MHC klasy II oraz stymulacji komórek swoistych i efektorowych do transformacji blastycznej i proliferacji. Fenotyp poszukiwanych swoistych limfocytów dobrze charakteryzuje marker CD154 (molekuła kostymulująca związana z prezentacją antygenu i uważana jako marker swoistości), z kolei dodatkowe barwienie CD19 (limfocyty B), CD3 (limfocyty T) oraz CD45 (wszystkie limfocyty krwi obwodowej) wskazuje, która z odpowiedzi immunologicznej - wrodzona czy swoista/komórkowa czy humoralna jest uruchomiona. Zasada testu w załaczniku nr 3.
Każdy test laboratoryjny charakteryzują dwa parametry: swoistość oraz czułość. Ze względu na fakt, że oceniana w teście reakcja immunologiczna charakteryzuje się wysoką swoistością, proponowany test jest wysoce swoisty (niski odsetek wyników fałszywie dodatnich). Ponadto, analiza swoistych limfocytów wymagająca użycia cytometru przepływowego (czułego urządzenia analizującego pojedyncze komórki), charakteryzuje się wysoka czułością (niski odsetek wyników fałszywie ujemnych). W związku z tym, proponowany test spełnia wymogi Krajowej Izby Diagnostów Laboratoryjnych.

POTENCJAŁ KOMERCJALIZACYJNY WYNALAZKU

Planowany model biznesowy to ścieżka licencjonowania na korzystanie z wynalazku. Test diagnostyczny może być wdrożony w każdym laboratorium diagnostycznym wyposażonym w cytometr przepływowy, w którym jest możliwość prowadzenia hodowli i stymulacji komórek pobranych z krwi obwodowej osoby badanej. W teście nie stosujemy całego replikonu wirusa, stąd niewymagane jest laboratorium o klasie BSL3 (biosafety level). Nasze rozwiązanie, będzie jedynym dostępnym na rynku tego typu testem diagnostycznym, który umożliwi ocenę przebiegu zakażenia wirusem SARS-Cov-2 oraz skuteczności szczepień i oceny odpowiedzi immunologicznej u pacjenta na różne warianty wirusa. Dzięki tej wiedzy zarówno lekarz prowadzacy jak i osoba zakażona, zyskują cenny czas na wdrożenie odpowiednio wcześnie konicznych procedur, tym samym chroniąc pacjenta przed ciężkim przebiegiem choroby i jej powikłaniami. Dodatkowo, daje to możliwość lepszej organizacji w przyjmowaniu pacjentów do szpitala selekcjonując osoby u których istnieje podejrzenie ciężkiego przebiegu choroby. Z kolei analiza odpowiedzi poszczepiennej pozwala na podjęcie decyzji co do dodatkowej immunizacji pacjenta.