Sposób krioprezerwacji pąków wierzchołkowych Lamprocapnos spectabilis (L.) Fukuhara ‘Alba’ z wykorzystaniem nanocząstek srebra, złota i miedzi

ZESPÓŁ AUTORSKI:

Politechnika Bydgoska im. Jana i Jędrzeja Śniadeckich

• dr hab. inż. Dariusz Kulus (kierownik),
• dr inż. Alicja Tymoszuk

CO MOŻNA OSIĄGNĄĆ DZIĘKI WYNALAZKOWI?

W ciągu ostatnich 100 lat doszło do gwałtownego zubożenia bioróżnorodności na Ziemi. Jej ochrona jest poważnym wyzwaniem dla współczesnego świata. Na przestrzeni lat opracowano różne strategie konserwacji zasobów genowych. Wciąż jednak poszukuje się bardziej efektywnych rozwiązań. Krioprezerwacja uważana jest za najbardziej skuteczną metodę ochrony bioróżnorodności. W technologii tej tkanki przechowuje się w ciekłym azocie, w temperaturze -196oC. Tak niska temperatura pozwala na spowolnienie aktywności metabolicznej komórek i ich długotrwałe przechowywanie. Aby jednak możliwe było przyżyciowe przechowywanie materiału biologicznego w warunkach kriogenicznych, konieczne jest jego odpowiednie przygotowanie. Znane są różne techniki krioprezerwacji. Niniejsze rozwiązanie stanowi nowatorski, nigdy wcześniej nie opisany sposób wykorzystania nanocząstek w badaniach z zakresu kriobiologii.
Nanocząstki (ang. nanoparticles; NPs) to niewielkie struktury o wymiarach od 1 do 100 nm. Znalazły one szereg zastosowań, m.in. w elektronice, medycynie, farmacji, rolnictwie, budownictwie. Nie zostały one jak dotąd wykorzystane w ochronie roślinnych zasobów genowych ani krioprezerwacji. Dzięki dużej pojemności i przewodności cieplnej, mogą one znacząco poprawić efektywność krioprezerwacji, której powodzenie zależy od tempa schładzania i rozmrażania komórek. Nanocząstki nie tylko podnoszą o 20-30% przeżywalność komórek w ciekłym azocie, ale także wpływają pozytywnie na dalszy wzrost i rozwój roślin w warunkach in vitro.

ISTOTA WYNALAZKU

Istotą rozwiązania według wynalazku jest sposób krioprezerwacji pąków wierzchołkowych Lamprocapnos spectabilis (L.) Fukuhara ‘Alba’ z wykorzystaniem nanocząstek srebra, złota i miedzi, z przeznaczeniem do dalszego wykorzystania w ogrodnictwie, medycynie lub przemyśle farmaceutycznym.
Lamprocapnos spectabilis (serduszka okazała) cieszy się dużym zainteresowaniem na rynku ogrodniczym. Ma także zastosowanie w kosmetologii, farmacji oraz medycynie jako źródło prozdrowotnych metabolitów, pomocnych w leczeniu uszkodzeń skóry, nowotworów oraz depresji. Pomimo dużego zainteresowania serduszką okazałą na rynku ogrodniczym, niewiele jest endemicznych populacji tego gatunku, które dodatkowo zagrożone są aktywnością licznych patogenów.
Pędy rośliny macierzystej tnie się na jednowęzłowe fragmenty pędu i wykłada na pożywkę MS (Murashige i Skoog 1962) na 5 – 7 dni, przy czym znaną pożywkę MS o pH 5,6 – 6,0 modyfikuje się poprzez dodatek nanocząstek srebra (AgNPs) lub złota (AuNPs), lub miedzi (CuNPs) o średnicy 10 – 20 nm i stężeniu 15 – 30 ppm. Prekulturę prowadzi się w pokoju wzrostowym w kontrolowanych warunkach świetlnych i termicznych. Uzyskane pąki wierzchołkowe umieszcza w 2,5 – 3,5% roztworze alginianu sodu na 5 – 15 minut. Kolejno, pąki wierzchołkowe z kroplą alginianu sodu przenosi się do roztworu chlorku wapnia (CaCl2) o stężeniu 80 – 120 mM na 20 – 40 minut. Uzyskane otoczkowane pąki wierzchołkowe płucze się 2 – 4 razy sterylną wodą destylowaną. Następnie, otoczkowane pąki wierzchołkowe umieszcza się na 15 – 25 minut w roztworze 2,0-M gliceryny oraz 0,4-M sacharozy. Kolejno, otoczkowane pąki wierzchołkowe przenosi się do roztworu witryfikacyjnego PVS3 (Nishizawa i in. 1993), który stanowi mieszaninę związków ochronnych, na 120 – 180 minut, przy czym znany roztwór PVS3 modyfikuje się poprzez dodatek AgNPs lub AuNPs, lub CuNPs o średnicy 10 – 20 nm i stężeniu 15 – 30 ppm. Tak przygotowany materiał roślinny (z niewielką ilością zmodyfikowanego PVS3) umieszcza się w 2-mL sterylnej polipropylenowej fiolce i zanurza w ciekłym azocie. W celu odtajania prób, fiolkę z materiałem biologicznym umieszcza się w łaźni wodnej o temperaturze 38 – 40oC na 2 – 4 minuty. Następnie, otoczkowane pąki wierzchołkowe płucze się roztworem płynnej pożywki MS (o pH 5,6 – 6,0) z dodatkiem 1,2-M sacharozy przez 20 – 40 minut. Kapsułkowane pąki wierzchołkowe wykłada się na pożywkę MS, przy czym znaną pożywkę MS o pH 5,6 – 6,0 modyfikuje się poprzez dodatek sacharozy w stężeniu 30 – 40 g·L-1, 6-benzyloaminopuryny w stężeniu 0,5 – 1,0 mg·L-1, agaru w ilości 7 – 9 g·L-1 oraz AgNPs lub AuNPs, lub CuNPs o średnicy 10 – 20 nm i stężeniu 15 – 30 ppm. Kultury in vitro prowadzi się w pokoju wzrostowym w kontrolowanych warunkach świetlnych i termicznych. Kulturę na pożywce wzrostowej prowadzi się przez 30 – 60 dni. Po tym czasie z kapsułkowanych pąków wierzchołkowych otrzymuje się nowe pędy.
Zaletą rozwiązania według wynalazku jest opracowanie skutecznej metody długotrwałej ochrony i przechowywania zasobów genowych serduszki okazałej, co jest ważne z punktu widzenia hodowli oraz ochrony bioróżnorodności. Metoda ta może być także wykorzystana w przechowywaniu linii komórkowych o szczególnie dużej aktywności metabolicznej – cennych dla przemysłu farmaceutycznego. Opracowana technologia umożliwia znaczne podniesienia współczynnika przeżywalności komórek w warunkach kriogenicznych. Połączenie krioprezerwacji z kulturami in vitro pozwala na szybkie odtworzenie materiału biologicznego wysokiej jakości w ramach bieżących potrzeb.

POTENCJAŁ KOMERCJALIZACYJNY WYNALAZKU

Biorąc pod uwagę fakt, że około 13% gatunków roślin wyższych zagrożonych jest wyginięciem, opracowanie skutecznych metod ochrony zasobów genowych w warunkach kriogenicznych doskonale wpisuje się w tematykę zrównoważonego rozwoju, zyskującym nowy wymiar w obszarze produkcji rolniczej i ogrodniczej.
Niniejszy wynalazek może znaleźć praktyczne zastosowanie w następujących obszarach:
- rolnictwo, ogrodnictwo, leśnictwo (producenci i hodowcy roślin),
- ochrona bioróżnorodności (banki genów),
- przemysł biotechnologiczny, zielarski i fitofarmaceutyczny/kosmetologiczny (przechowywanie linii komórkowych o szczególnie dużej zdolności do biosyntezy cennych metabolitów o charakterze prozdrowotnym).
Uzyskane wyniki mogą być także wykorzystane w innych dziedzinach nauki, np. medycynie, w przechowywaniu komórek macierzystych.